原位雜交(In situ hybridazation)
固定
收集斑馬魚(yú)的胚胎,在Holfretor水中培養(yǎng),到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí),原位雜交,用蛋白酶去除卵膜,用4%多聚甲醛固定,在4℃保存,二十四小時(shí)后用50%2%多聚甲醛溶液洗,然后換成,在-20C 保存,待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用處理,去除色素?;蛘呤褂帽斤畴逑∪芤号囵B(yǎng),可阻斷色素的形成)
在原位雜交過(guò)程中,熒光原位雜交,需要使用標(biāo)記的核酸探針,通常是在性核素或非性物質(zhì)中標(biāo)記的。這些探針可以通過(guò)不同的方式制備,例如從已知序列的DNA或RNA制備,或者通過(guò)使用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)和合成新的探針。
在進(jìn)行原位雜交時(shí),細(xì)胞或組織需要固定在適當(dāng)?shù)闹С治锷?,例如載玻片。然后,探針與細(xì)胞或組織中的DNA或RNA進(jìn)行雜交,通常是在加熱條件下進(jìn)行的。接下來(lái),通過(guò)洗滌和顯影步驟去除未結(jié)合的探針和信號(hào)增強(qiáng)劑,后用顯微鏡觀(guān)察雜交信號(hào)的位置。
核酸原位雜交可根據(jù)其檢測(cè)物而分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交;根據(jù)其所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA,染色體原位雜交, RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經(jīng)過(guò)組織細(xì)胞的固定,預(yù)雜交,雜交,沖等一系列洗步驟及自顯影或酶法顯色以顯示雜交結(jié)果。
我們?cè)谶@兒介紹的是整胚原位雜交,不同于一般的在載片上對(duì)細(xì)胞和組織切片進(jìn)行探針雜交及檢測(cè)的原位雜交,
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